2020年6月，UK 100K针对部分使用Congenica软件的13,037名参与者分析结果在Nature发表，通过全国范围内临床试验和研究的标准一体化加速了罕见病病因的发现。除了编码区变异外，WGS还可以识别非编码区变异，探索调控区变异将成为未来研究和临床干预的热点。

生物信息学分析(扩展数据Fig 2-4)后，最大的一组包含10,259名参与者(maximal set of unrelated participants, MSUP)的病例中鉴定了172,005,610个变异。这些变异包括157,411,228(91.5%)个SNVs, 14,594,382(8.5%)个≤50 bp的Indels(扩展数据Fig 5)。其中48.6%的SNV和40.8%的Indel未包含在主要的公共变异数据库中(Fig 1d)，54.8%的次等位基因变异频率为1。其中82.6%为新发变异，新发变异中9.08%的次等位基因变异频率大于1，通常由相似血统群体的个体携带(Fig 1e)。如果SNV和Indel在我们的数据集中很常见，那么它们在主要的变异数据库中有很好的代表性，但是如前期预测多数变异都非常罕见且大多数尚未被收录。通过两种算法我们从13,037名参与者中筛选出>50bp 的缺失177,550个以及复杂结构变异如倒位，然而这些可能并不可靠因为无法解释不同个体的结果(补充信息)。只有13个(0.1%)个体具有非标准WGS检测的性染色体核型结果(扩展数据Fig 3e-g)。根据入组标准，多数家庭为单样本检测(Fig 1f)，但是从遗传信息(补充资料)中获得家庭成员关系。

逐个分析15种罕见病小组结果，回顾科学文献建立诊断级基因(diagnostic-grade genes, DGGs)清单并进行相应的转录本(补充信息)分析。清单中基因数目从包括从与妊娠胆汁淤积症相关的2个基因，到与神经发育障碍相关的1,423个基因不等。不同列表中的基因互不排斥，因为不同基因会引起多种疾病的病理学异常(Fig 2b)。12个专家组成的MDT小组确认与HPO表型匹配的DGGs中观察到的罕见变异，根据指南分为“致病”或“可能致病”，并评估其对疾病的贡献度为“完全”还是“部分”。如果单一CNV缺失可导致疾病表型，则该变异的贡献被评估为“完全”,否则被评估为“部分”。7,065例(16.1%)患者中1,138例发放了包含分子诊断结果的临床报告，包括329个DGGs小组的1,103个致病变异(731个SNVs，264个Indels，102个缺失和6个复杂结构变异)(补充表2)。995个SNV和Indels中的266(26.7%)个变异为新发变异，因为未被HGMD和ClinVar收录。根据临床报告数量对329个DGGs进行排序，排在DGGs前三位的基因是BMPR2、ABCA4、TNFRSF13B占比报告的1/4。排在其后的是19个DGGs，约占1/4，剩余为307个DGGs(Fig 2c和扩展数据Fig6)。不同种类疾病的诊断率从原发性膜增生性肾小球肾炎的0%(0/184)到遗传性视网膜疾病的53.9%(391/725)不等(Fig 2b)，诊断率的不同可能与入组前表型和基因型预筛选、疾病遗传方式、对遗传病知识的了解不同相关。

使用常染色体测序深度>35×的PCR-free WGS可以为临床报告提供更丰富的信息。例如，有1例Hermansky-Pudlak综合征病例WES未发现异常，而WGS发现了1个HPS6 起始端缺失的致病性SNV。与英国Biobank、INTERVAL和哥伦比亚大学慢性肾病外显子组测序研究(补充信息)的读长覆盖率相比， WES成本较低但已知致病性SNV或Indel的基因组位点内和位点之间的覆盖率差异也远远大于WGS(扩展数据Fig 7)。本研究中有938个常染色体SNV，WES数据集中覆盖率不足导致可靠的常染色体SNV数量在25到99之间(2.67–10.5%)(扩展数据Fig 7)。此外，由WES发现的跨越多个外显子或单一外显子的部分缺失可能不可靠，本研中的102个不同缺失中(长度范围203 bp–16.80 Mb;平均值786.33 kb;中位数15.91 kb)有22个(21.6%)只与一个外显子重叠。已有临床和研究显示WES覆盖度可能不同，但我们无法获得用于比较的临床数据集。

表型量化可以辅助查找疑难病例的遗传病因。缺乏DGGs编码蛋白的患者，缺乏临床表型，通过WGS数据寻找复合杂合变异进行解释。两名伴有原因不明严重出血性疾病的患者发现其致病原因是由于血小板膜上缺乏αIIbβ3整合素而在ITGB3 的9号内含子中携带复杂变异:一例携带串联重复序列，另一例携带SINE-VNTR-Alu(SVA)逆转录转座子，均未被结构变异工具筛选出来，但通过长读长测序发现(扩展数据Fig 8a-e)。第3例患者由于红细胞膜中缺乏RhD和RhCE蛋白而患有严重的溶血性贫血，发现是由RHAG 中的大片段串联重复导致(扩展数据Fig 8f)。

本研究的研究结果为治疗决策提供了依据:KMT2B 介导的早发性肌张力障碍患者接受脑部深度刺激治疗;DIAPH1 相关的血小板减少症和耳聋患者术前使用艾曲波帕Eltrombopag治疗;1例因SRC13 基因功能获得性突变导致严重血小板减少、骨髓纤维化和出血通过异体基因造血干细胞移植治愈。部分研究结果帮助实现了患者护理的分层管理:研究发现NFKB1 变异可导致原发性免疫障碍，是多变异免疫缺陷中最常见的单基因原因，伴有不明原因脾肿大且癌症风险增加;与19例ACTN1、CYCS或TUBB1变异引起的血小板减少症相比，27例由ANKRD26、ETV6 或RUNX1 异引起的单一性血小板减少症的恶性肿瘤风险更高。部分研究结果也提高了预后的准确性:BMPR218 和EIF2AK419 突变导致的肺动脉高压预后比平均预后差, 对四个基因(ATP13A3、AQP1、GDF2、SOX17 ) 进行预后相关研究后已经进行了报道。

罕见病遗传原因的发现通常需要在多个相似病例中有体现，Matchmaker Exchange(补充信息)可汇总来自不同研究的病例，分析后发现了新的致病原因SLC18A222 和WASF123。在该大型研究中统计分析数据后发现了致病原因。

通过BeviMed鉴定不同遗传模式下基因与罕见病之间的相关性(补充信息)，如果疾病表型一致即用同一标签标记(补充表3)，每组病例病例数从3例(Roifman综合征)到1,101例(肺动脉高压)不等。独立分析每个基因标签对，关联后验概率>0.75作为遗传病因的强证据。为了解释标签之间的相关性,记录获得最高关联后验概率的标签。根据基因和标签的因果关系，BeviMed综合分析遗传模式的后验概率，即变异导致疾病风险的级别(例如5′非翻译区的变异或功能丧失变异)以及每个特定变异的致病性。

分析显示95个基因和29个标签之间存在具有有力证据的关联，后验概率分布显示阳性预测值可达93%。95个基因中68个基因建立了DGGs，11个基因是2015年以后发现的，仍有16个基因需要进一步验证(Fig 2d和补充表3)。因此，在真阳性预测值为83%情况下95个关联中有79个得到证实，这与对照统计分析中约79%的阳性预测值(补充信息)基本一致。约611.3个病例可以用79个已确认变异进行解释，其中115.6个病例可以用BMPR2 与肺动脉高压的相关性来解释。95个基因中51个基因的关联完全依赖于来自单基因变异的证据，显示了罕见变异关联分析统计模型的作用。只有3个未经证实的关联依赖于1个以上病例携带的等位基因证据，显示了对隐性关联分析的稳健性。有一个基因GP1BB，BeviMed推断的遗传模式与文献报道不同并对之前的假设表示质疑。这些结果和本项目的其他发现表明，对大型表型异常罕见病队列研究中收集的遗传和表型数据进行统一分析是遗传学发现的有力途径。

一些罕见遗传性疾病(例如，家族性高胆固醇血症、复杂免疫缺陷、血小板减少症和血管性血友病Von Willebrand病)的诊断和临床特征会参考数量性状评估致病性。对数量性状影响较大的等位基因倾向于处于极端尾部，从而产生负选择压力。这样的等位基因比较罕见，对UK Biobank样本进行WGS并对单变量数量表型的尾部进行分析确认可能介导红细胞相关病理学的基因，通过计算优化罕见变异分析能力。等位基因频率

对红细胞全血细胞计数GWAS的表型分析多基因预测因子在各自尾部的群体分布中分别显示左移和右移(Fig 3d)。然而这些变化并没有高斯方差模型预测的那么突出，差异可能由于罕见等位基因在尾端的密度过高(表型峰度=6.9)。左尾、未选择、右尾的WGS-GWAS没有产生新的关联。BeviMed分析中将每个极性尾端组作为一组病例进行分析，确定了12个后验关联概率>0.4的基因(Fig 3e)。已知致病变异HBB 和TFRC 会引起微细胞性贫血，其他基因包括CUX1 和ALG1 均为可能的候选基因。这些结果(补充表3)表明，在表型健康人群中进行数量极值分析可识别医学相关基因座。

调控元件致病变异

调控元件中的罕见变异可通过干扰转录或翻译而致病，最新研究表明，至少在神经发育异常疾病中，一部分新发非编码区SNVs可能源于相关组织中活跃的调控元件。相比SNVs，较大的变异对调控元件的破坏性更大。在与隐性造血相关疾病相关的246个DGGs的调控元件中寻找致病变异，包括大片段缺失(补充信息)。首先，为六种血液细胞类型定义一组活性调节元件，即“regulome”，通过ChIP-seq鉴定转录因子结合位点，即被称为RedPop的结合区域。RedPop可检测转座酶的染色质测序(ATAC-seq)和调控元件中组蛋白H3 K27乙酰化(H3K27ac)的ChIP-seq覆盖情况(补充信息)。通过分析基因组邻近性和启动子捕获pcHi-C，将调控元件与基因连接起来。其次，根据细胞类型及与三类罕见病小组(出血、血栓和血小板疾病、原发性免疫疾病、干细胞和髓系疾病)的相关性，将调控因子regulome与三类罕见病中的一个或多个匹配(补充表3)。最后，在相关细胞类型的调控元件中发现1例罕见的纯合子或半合子缺失病例，并与该病例所在小组DGGs有关。按照筛选标准在DGGs小组罕见编码区变异中查找复合杂合缺失并探讨与疾病相关性，对3个病例进行了解释：1例是原发性免疫疾病患者，在ARPC1B 的5′端非翻译区发生缺失并导致移码突变的复合杂合突变，1例是患有自闭症和血小板减少症的男孩，携带GATA1 增强子的半合子缺失，1例是患有多种自身免疫相关的血小板减少症，携带内含子CTCF结合位点处LRBA42 的纯合子缺失。

携带X连锁变异的自闭症男孩缺少了GATA1 增强子和HDAC6 的1-4号外显子(Fig 4和扩展数据Fig9)，除轻度红细胞生成障碍外，血小板计数持续偏低，平均血小板体积升高(15.1 fl)，红细胞参数正常。电镜分析显示血小板α颗粒含量低于正常水平，干细胞培养显示巨核细胞血小板形成不良。这些都是编码区携带致病性GATA1 等位基因患者的典型症状。血小板中GATA1水平极低，增强子缺失导致转录减弱。微管中HDAC6会促使Lys40α-微管蛋白脱乙酰化，而HDAC6缺失会导致血小板中乙酰化α-微管蛋白增加。小鼠体内Hdac6 敲除后α-微管蛋白乙酰化发生异常，从而导致出血及其他异常。因此，GATA1 表达的减少和HDAC6的缺失共同导致了以前未见过的伴有神经发育异常的血小板减少综合征。LRBA的1号内含子CTCF结合位点发生纯合子缺失的患者，由于失去对多种自身抗原的耐受，表现出自身抗体介导的全血细胞减少，这是LRBA功能受损的特征。

采用以上方法鉴定调控元件中的致病性缺失，鉴别非编码区的致病性SNVs。对CADD评分>20并在DGG小组中具有高影响力的编码区变异SNVs进行重点研究。使用该方法又发现了2个潜在影响蛋白功能的致病变异AP3B1 和MPL 。对携带MPL 变异(1号染色体:43803414G>A)(扩展数据Fig 10)的1名10岁的男孩进一步详细研究发现，MPL 编码巨核细胞生长因子血小板生成素受体。MPL缺失会导致慢性巨核细胞血小板减少症，该SNV位于RedPop鉴定的巨核细胞特异性调控元件中。CADD=21.8，gnomAD中未报道,MPL第10号外显子复合杂合缺失。该突变导致启动子活性降低50%并导致导致血小板MPL水平显著降低。MPL阴性患者骨髓中巨核细胞仅中度减少，而MPL 阳性患者由于骨髓几乎没有巨核细胞而导致血小板严重减少，血小板计数为45×10⁹l⁻¹。由于SNV无法完全消除对MPL转录的影响，该男孩的临床表型比MPL 阴性病例表现轻微。

讨论

全国范围内临床试验和研究的标准一体化加速了未知罕见病病因的发现。英国国家医疗服务系统(NHS)的WGS诊断服务从每月8,000个样本增加到30,000个样本。为了实现这一目标，临床基因组实验室的数量减少到7个，同时组织WGS、信息学和基因组学的统一培训。统计学的发展对新数据的解释和病人知情同意随访以及后续实验至关重要。此外，可能需要长读长测序方法解决目前WGS复杂结构变异分析过程中遇到的困难。UK Biobank样本的WGS工作已经启动，用于确定罕见变异与数量表型极端尾部的相关性。而这些均未被GWAS包括，这些相关性分析可以筛选符合孟德尔遗传模式的致病原因。不同细胞类型的表观遗传学数据结合WGS可以识别非编码区包含致病性变异的调控元件，探索调控区变异是未来研究和临床干预的热点。

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Turro, E., Astle, W.J., Megy, K. et al. Whole-genome sequencing of patients withrare diseases in a national health system. Nature 583, 96–102 (2020).